關于微生物的作用和生存環境

作用：

√食物鏈√物質鏈

√食品工業√生態群落 

√制藥工業（疫苗、抗生素）.......

生存環境：

√土壤，空氣，水體 

→某些惡劣條件

-海底 

-死海 

-撒哈拉沙漠 

-極地(—88℃)

-火山口的溫泉(+98℃)

-原油礦床

√微生物幾乎無處不在

關于微生物限度檢測

   初始污染菌：產品消毒、滅菌前的細菌總數，可判斷檢品售細菌污染的程度以及生產單位所用的原料、工具設備、工藝流程、生產人員的衛生狀況，是對檢品進行衛生學評價的綜合依據。

關于微生物計數法

 檢查非規定滅菌產品售微生物污染程度的方法

 微生物計數法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數。

 當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規定的微生物限度標準時，應按下述規定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結果的判斷等。除另有規定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。

 計數方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數法（Most-Probable-Number Method,簡稱MPN法）。MPN法用于微生物計數法時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。

 供試品檢查時，應根據供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數方法，檢測的樣品量應盡能保證所獲得的試驗結果能夠判斷供試品是否符合規定。所選方法的適應性須經確認。            

關于初始污染菌檢測有哪些？

環 境：微生物計數試驗環境應符合微生物限度檢查的要求。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。潔凈空氣區域、工作臺面及環境應定期進行監測。（參考無菌檢查法對環境的要求）

設 備：微生物限度儀（微生物過濾裝置）、菌落計數器（如需要）

試   劑：沖洗液等同無菌檢查法。

培養基：胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）

           沙氏葡萄糖   

           瓊脂培養基（SDA）

菌   株：金黃色葡萄球菌CCMCC(B)26003   

           銅綠假單胞菌CMCC(B)10104

         枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501     

         白色念珠菌CMCC(F)98001

    黑曲霉CMCC(F)98003             

    大腸埃希菌CMCC(B)44102

關于供試液制備原則

根據供試品的理化特性與生物特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，契溫度不應超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養基，不得超過1小時。樣品浸提時，所用緩沖液應沒過樣品頂端，使得樣品被*浸沒。

關于常用供試液制備方法

（如果下列供試液制備方法經確認均不適用，應建立其他適宜的方法）

（1）水溶性供試品：

取供試品，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養提液基溶解或稀釋制成1：10供試液。若需要，調節供試液PH值至6-8.必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

（2）水不溶性非油脂類供試品：

取供試品，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養基制備成1：10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%（ml/ml）的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調節供試液PH值至6-8.必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。

（3）油脂類供試品：

取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使得=溶解，或與少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40℃（特殊情況下，最多不超過45℃），小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預熱的稀釋液使成1：10供試液，保溫，混合，并在最短時間內形成乳狀液。必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進一步10倍系列稀釋。

（4）膜劑供試品：

取供試品，剪碎，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養基，浸泡，振搖，制成1：10的供試液。若需要，調節供試液PH值至6-8.必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。

關于抗菌活性的去除或滅活

 供試液接種后，按下列“微生物回收"規定的方法進行微生物計數。若試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值小于菌液對照組菌落數值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。

（1）增加稀釋液或培養基體積

（2）加入適宜的中和劑或滅活劑

（3）采用薄膜過濾法

（4）上述幾種方法的聯合適用

若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗菌回收的失敗，表明供試品對該試驗菌具有較強抗菌活性，同時也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌沒有抑制作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數方法適用性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為低稀釋級的供試液進行供試品檢查。

關于微生物限度檢測--供試品監檢查--平皿法

 平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規定外，取規定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和菌數測定，每稀釋級每種培養基至少制備2個平板。

 培養和計數：除另有規定外,胰酪大豆胨瓊脂培養基平板在30~ 35℃培養3~ 5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板在20~ 25~C培養5~ 7天，觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數，計數并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數后，計算名稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落數平均值不小于15 ,則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。

 菌數報告規則： 需氧菌總數測定宜選取平均菌落數小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數測定宜選取平均菌落數小于100cfu的稀釋級，作為菌數報告的依據。取最高的平均菌落數，計算1g、1ml或10cm2供試品中所含的微生物數，取兩位有效數字報告。

 如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅低稀釋級的平板有菌落生長但平均菌落數小于1時，以< 1乘以低稀釋倍數的值報告菌數。

關于微生物限度檢測--供試品檢查--薄膜過濾法

  除另有規定外，按計數方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備。取相當于1g、 Iml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數較多時，可取適宜稀釋級的供試液，照方法適用性試驗確認的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基上培養。

培養和計數：培養條件和計數方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數應不超過100cfu。

菌數報告規則：以相當于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌落生長，以< 1報告菌數（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品)，或< 1乘以低稀釋倍數的值報告菌數。

關于微生物限度檢測--結果判斷

  氧菌總數是指胰酪大豆胨瓊脂培養基上生長的總菌落數(包括真菌菌落數)；霉菌和酵母菌總數是指沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的總菌落數(包括細菌菌落數)。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的細菌使霉菌和酵母菌的計數結果不符合微生物限度要求,可使用含抗生素(如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養基或其他選擇性培養基(如玫瑰紅鈉瓊脂培養基）進行霉菌和酵母菌總數測定。使用選擇性培養基時，應進行培養基適用性檢查。若采用MPN法,測定結果為需氧菌總數。 

各品種項下規定的微生物限度標準解釋如下: 

10cfu：可接受的最大菌數為20; 

100cu：可接受的最大菌數為200;

1000f：可接受的最大菌數為2000， 依此類推。 

若供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總教的檢查結果均符合該品種項下的規定，判斷供試品符合規定；若其中任何一項不符合該品種項下的規定，判供試品不符合規定。

關于微生物限度檢測--純化水微生物限度檢測

Q:純化水微生物限度檢測方法？